Hak cipta Indah Fitriani desainwebsite.net
Aplikasi Northern Blotting
Northern Blotting telah telah sering digunakan bersamaan juga PCR dan microarray sering digunakan untuk tujuan diagnostik atau klinis.
Protokol Northern Blotting digunakan dalam riset biologi molekular untuk:
- pendeteksian mRNA ukuran catatan
- studi RNA penurunan(pangkat,derajad)
- studi RNA dapat mendeteksi sebagai alternatif menyambung
- studi RNA umur-paruh
- studi untuk memindahkan kemungkinan RNA dan cistron translasi.
- sering digunakan untuk mengkonfirmasikan dan memeriksa transgenik binatang
Kerugian Northern Blotting meliputi:
- Sering radioaktifitas digunakan. Metoda baru pendeteksian tidak perlu radioaktif
- Keseluruhan proses Northern Blotting perlu banyak waktu
Metoda Northern Blotting yang baku secara relatif lebih sedikit sensitip dibanding nuclease pengujian kadar logam dan RT-PCR. Kepekaan Northern Blotting ditingkatkan dengan penggunaan nilon selaput bermuatan positif, penggunaan suatu antisense pemeriksaan yang sangat spesifik.
Prosedur berikut ini mengkombinasi lima teknik laboratorium dan memungkinkan para peneliti untuk dapat mendeteksi dan menganalisis urutan DNA tertentu. Dasar pendeteksian urutan spesifik ini adalah hibridisasi asam nukleat. Hasilnya menunjukan tidak hanya urutan tertentu ada dalam sampel berbeda tetapi juga jumlah urutan tersebut dalam suatu genom dan ukuran fragmen restriksi yang mengandungnya dengan cara ini memungkinkan membandingkan DNA dari individu atau bahkan spesies berbeda.
Karena kekuatan selektif dari hibridisasi asam nukleat materi awal untuk analisis dapat berupa genom organismenya. panjang DNA yang berlebihan ini akan menghasilkan begitu banyak fragmen restriksi sehingga jika semuanya ingin ditampakkan dengan pewarna akan tampak sebagai suatu noda dalam elektroforesis gel dan bukannya suatu pita yang terpisah.
Sebaliknya hanya pita DNA yang diinginkan saja yang ditampakkan dengan menggunakan probe berlabel. Probe ini terdiri atas banyak salinan dari potongan DNA untai tunggal yang berlabel radioaktoif atau berfluorosens yang akan berhibridisasi pasangan basa dengan DNA yang diinginkan sebelum hibridisasi dan yang akan diuji dipindahkan dengan aksi kapiler blotting dari gel ke penumpu padat selembar kertas nitroselulose atau nilon. Seluruh proses hibridisasi dikenal sebagai southern blotting. Kelima prosedur tersebut adalah:
1.penyiapan fragmen restriksi
Sampel yang akan diuji diidentifikasi sebagai sampel 1, 2, 3 dipersiapkan dari sumber yang tepat. Enzim restriksi ditambahkan pada ketiga sampel DNA untuk menghasilkan fragmen restriksi.
2.elektroforesis campur fragmen restriksi dan setiap sample dipisahkan dengan elektroforesis setiap sel membentuk suatu pola pita yang khas akan lebih banyak lagi pita daripada yang ditunjukkan disini dan pita itu tidak akan kelihatan jika tidak diwarnai.
3.blotting aksi kapiler menarik larutan alkali ke atas melewati gel dan melewati selembar kertas nitroselulose yang diletakkan diatasnya memindahkan DNA ke kertas tersebut serta mendenaturasinya dalam proses tersebut untai tunggal dan melekat pada kertas yang ditempatkan dalam pita tempat seperti pada gel.
4. hibridisasi dengan probe radioaktif
Blot kertas dipaparkan dalam larutan yang mengandung probe berlabel radioaktif. probe ini merupakan DNA untai tunggal yang komplementer terhadap urutan DNA yang diinginkan dan probe ini dilekatkan ke fragmen restriksi yang mengandung urutan komplementer dengan cara berpasangan basa.
5.autoradiografi
Selembar film fotografik diletakkan diatas kertas radioaktif atas pada probe yang terikat memapar film untuk membentuk bayangan yang sesuai pita DNA spesifik pita yang mengandung DNA yang berpasangan basa dengan probe itu. Northern dan southern blotting memudahkan hibridisasi dengan molekul asam nukleat yang dipisahkan melalui elektroforesis.
Misal: kita ingin mengetahui perihal cacat dalam tubuh tikus mutan yang menyebabkan terlalu rendahnya jumlah albumin yaitu protein yang lazimnya disekresi oleh sel hati ke dalam darah dalam jumlah besar untuk ini kita mula-mula mengambil sampel jaringan hati yang serupa baik dari tikus cacat maupun normal /kontrol sama dengan menghancurkan sel itu dalam suatu deterjen kuat agar nuclease sel yang mungkin menyebabkan penguraian asam nukleat menjadi tidak aktif sesudah dipisahkan.
Rekomendasi Artikel: