Teknik pembuatan kultur jaringan primer pada dasarnya adalah sama. Sel, jaringan dan organ hewan diambil dari tubuh hewan dan mulai dipelihara di dalam kondiosi in-vitro. Selama di dalam kultur primer semua kebutuhan sel baik sel tunggal (kultur sel), sebagai bagain dari jaringan (kultur jaringan) maupun sebagai bagian dari organ (kultur organ/bakal organ) harus dipenuhi, agar sel dapat hidup dan menjalankan fungsi normalnya. Untuk kepentingan ini pemeliharanaan kultur sel manjadi bagian penting dari teknik kultur jaringan hewan.
Kultur jaringan primer dapat diperoleh dengan cara, baik migrasi sel-sel dari sutu fragmen jaringan yang melekat pada substrat atau dengan disagregasi sel dari sutu jaringan dengan mekanis atau enzimatis untuk mendapatkan suspensi sel yang akan menempel pada subsrat.
Pada kegiatan ini mahasiswa diberikan kesempatan untuk berlatih melakukan kultur berbagai jenis jaringan yang dikehendaki.Untuk keperluan ini dipakai embrio ayam berumur 4,5 sampai 6 hari.
5. Tujuan
Setelah melakukan kegiatan ini diharapkan mahasiswa:
a. Memahami prinsip-prinsip kultur jaringan
b. Mengetahui berbagai kebutuhan pada teknik kultur jaringan
c. Memiliki ketrampilan yang baik dalam melakukan kultur jaringan
6. Prinsip
Kultur jaringan adalah teknik pemeliharaan jaringan di dalam kondisi in vitro. Seperti halnya pada kultur organ maupun kultur bakal organ, kultur jaringan juga mempertahankan karakteristik jaringan seperti saat jaringan berada di dalam kondisi in-vivo. Jaringan yang diperlukan diisolasi dari organ yang bersangkutan. Selanjutnya, jaringan ini dipelihara di dalam medium yang dilengkapi dengan serum di dalam suhu yang sesuai dengan asalnya.
7. Alat dan Bahan
Alat yang diperlukan
a) Cawan petri
b) Mikroskop (Dissecting microscope)
c) Pipet pasteur
d) Multiwell plate atau cawan kultur
e) Mikroskop fasekontras
f) Inkubator
g) Shaker
Bahan yang diperlukan:
a) Embrio ayam
b) Larutan garam seimbang (HBSS)
c) Medium 199 Earle’s
d) Etanol 70%
e) Kapas steril
f) Filter steril (millipore filter dengan porositas ³ 0,4 mm)
8. Metode Pengukuran
Keberhasilan pertama dari percobaan ini adalah tidak terjadinya kontaminasi pada kultur. Hal ini bisa dilihat secara langsung dari kondisi medium kultur pada 24 jam pertama atau paling lambat 48 jam pertama setelah dilakukan kultur. Ukuran keberhasilan yang ke dua adalah kesehatan jaringan selama dipelihara di dalam kondisi in-vitro. Dan ukuran keberhasilan ke tiga adalah berfungsinya jaringan yang dipelihara sebagaimana mestinya (seperti fungsinya di dalam kondisi in-vivo).
9. Cara Kerja
a) Mengeluarkan embrio ayam dari cangkangnya;
b) Memasukkan embrio ke dalam larutan garam seimbang dan dicuci
c) Memindahkan embrio ayam ke dalam wadah lain yang berisi larutan garam seimbang segar;
d) Mengambil saluran pencernaan embrio ayam;
e) Memisahkan antara esofagus, lambung, dan usus halus;
f) Memasukkan ke dalam cawan petri yang berisi larutan garam seimbang (HBSS)
g) Memotong-motong jaringan tersebut dengan ukuran + 1x1x1 mm
h) Mencuci potongan-potongan tersebut dengan menggunakan larutan garam seimbang
i) Memindahkan potongan-potongan tersebut kedalam wadah yang berisi larutan garam seimbang.
j) Menanam eksplan tersebut ke dalam cawan kultur yang sebelumnya telah ditambahkan medium 199.
k) Memelihara kultur tersebut di dalam inkubator CO2 pada suhu 390C;
f) Mengamati serta merekam perkembangan yang terjadi mulai 24 jam setelah penanaman hingga 1 minggu.
